Bonjour,
Merci beaucoup pour cette réponse très complète et objective c'est ce dont
j'avais besoin pour bien compléter mes cours. Super.
J'ai eu l'occasion d'aller visiter le genoscope à Evry cette semaine et j'ai
eu la surprise de constater qu'ils utilisent ce système pour séléctionner
leurs clones.
Ils ont quand même participer au séquençage du génome humain, de plusieurs
organismes....... c'est quand même suprenant ........
Nico

"Jerry M." <jerrym_1995@yahoo.fr> a écrit dans le message de news:
svsp51lkj0mivvdfvgvpucdtvvbmbp7aql@4ax.com...

On Tue, 12 Apr 2005 16:11:49 +0200, "Nico" <dirtncross7@wanadoo.fr>
wrote:

"eric" <charpan25@etu.unige.ch> a écrit dans le message de news:
42567e2a@nntp.unige.ch...

Nico wrote:

de cadre de leture?
cela viendrait donc du clonage et non pas du sys blc/bleu lui

même!!!!!

Si je me souviens bien (c'est loin tout ça). Mais dans le système
balance bleu, l'insertion d'un insert dans le plasmide inhibe LacZ qui
ne va plus pouvoir cliver L'iptg Xgal.
Or il est possible que l'insert reste en phase avec le cadre de lecture
de LacZ donc il y a toujours synthèse de ßgal (produit de lacZ) et les
bactéries sont blanches.

Je dis ça de mémoire, mais je peux confirmer si je remet la main sur

une

carte de bluescript. sinon Jerry va me corriger.

Du coup le système blc/bleu est au mieux efficaces dans 60% des cas
(entendre colonies). C'est pour cette raison que quasiment plus

personne

ne l'utilise à l'heure actuelle. Car parfois il fallait piquer les
colonies blanches pour avoir le bon résultat. Du coup le système

faisait

statistiquement perdre plus de temps qu'en gagner. Donc aurevoir.

le pb c'est que même si il y a phase avec le gene lacZ il n'a pas de

raison

que lacZ s'exprime puisque que la ligation a lieu dans lacZ.......

Bonjour, s'cusez-moi du retard, je viens à peine de refaire surface
après une redoutable avalanche de boulot.

Pour commencer et revenir au sujet, c'est effectivement un peu exagéré
de dire que le système est caduc et que plus personne ne l'utilise. Au
contraire, il a certainement encore de nombreux bons jours devant lui
à cause de sa facilité d'utilisation, de son coût bon marché, de son
côté pédagogique, pour des raisons historiques et sentimentales, à
cause de son excellente et néanmoins très exagérée publicité, etc.

Personnellement, je recommande le coloriage bleu/blanc assez souvent,
mais uniquement pour garantir une grande variabilité parmi les clones
à choisir: si quelqu'un ne veut en analyser qu'une demi-douzaine, je
lui conseille d'en prendre deux blancs, deux bleus, et deux
intermédiaires, sans pouvoir la plupart du temps prédire de quelle
couleur sera le clone recherché. Il arrive parfois que la construction
correcte soit bleue, surtout lorsque les fragments insérés sont de
petite taille: une insertion dans lacZ-alpha n'inactive pas
systématiquement son activité, parceque la partie N-terminale n'est
vraiment pas importante et que la partie C-terminale peut être
fusionée à pratiquement n'importe quoi tout en restant fonctionnelle
(sauf à des domaines transmembranaires, par exemple).

Le fait est néanmoins qu'il s'agit d'une technologie maintenant
bientôt vieille de près d'un tiers de siècle, et qu'aujourd'hui les
gens ont parfois des critères un peu plus rigoureux/difficiles que
jadis. En effet, quiconque aura travaillé un peu avec le système
bleu/blanc, par exemple en construisant des banques génomiques ou en
insérant des fragments d'ADN variés, se sera rendu compte que parmi
les colonies blanches il y a non seulement aussi toujours des colonies
bleues, d'un joli bleu "normal", mais parfois aussi d'autres d'un bleu
très foncé presque noir, ou d'un bleu clair, ou même très très clair.
Sans parler de microcolonies blanches qui finissent par devenir bleues
si on leur laisse le temps, ou de colonies de taille normale mais qui
sont blanches à l'extérieur et bleues au centre ("fish eye").

Un système aussi idéal voudrait également que les colonies blanches
aient un vecteur portant un insert, or avec le temps on s'apperçoit
aussi que systématiquement un certain nombre de plasmides "blancs"
n'ont pas d'insert...

Comment expliquer alors qu'un système aussi parfaitement binaire que
bleu/blanc puisse donner autant de réponses intermédiaires, si ce
n'est équivoques?

La principale raison vient du fondement de l'approche elle-même: on
interprète la destruction d'une fonction (incapacité de colorier le
mileu) comme le signe de l'évènement constructif recherché
(l'incorporation d'un insert dans le vecteur), les deux évènements
étant supposés liés de façon parfaitement harmonieuse.

Avec cette approche un brin trop simpliste, il y a plusieurs façons
pour que le système tourne mal, colonies bleues avec insert et
colonies blanches sans insert.

Pour obtenir des colonies bleues malgré que le vecteur porte un
insert, il suffit par exemple que le fragment inséré restaure la
transcription et/ou la traduction du fragment lacZ-alpha qui se trouve
en aval du site de clonage multiple (MCS). N'oublions pas que le MCS
se trouve toujours *tout au début* de lacZ-alpha, et que les premiers
codons -totalement artificiels-, ceux justement que l'on interrompt
par incorporation d'un insert, ne sont pas du tout essentiels à
l'alpha complémentation. Des promoteurs bactériens gratuits plus ou
moins forts existent à peu près un peu partout le long d'une séquence
d'ADN aléatoire, en moyenne un tous les 1000-5000 paires de bases
(idéalement TTGACA..15-20..TATAAT, mais il y a énormément de
tolérance); la transcription accidentelle du fragment lacZ-alpha en
aval du MCS est donc quelque chose de très fréquent. Il est un peu
plus difficile par contre de restaurer accidentellement une traduction
correcte: il faut pour cela un semblant de site de liaison au ribosome
(un AGGA par exemple peut suffire) suivi d'un AUG ou d'un GUG à
quelques 6-18 nucléotides de distance, le tout dans le bon cadre de
lecture. Plus difficile, mais pas impossible, loin de là... ça arrive
au point que parfois on voit des colonies d'un bleu encore plus foncé
que le bleu produit par le vecteur vide. Finalement, une fusion toute
simple avec un fragment d'ADN codant en cadre de lecture est aussi
parfaitement possible: la B-galactosidase a une remarquable propriété,
et c'est celle de pouvoir être fusionnée dans sa partie N-terminale
avec à peu près n'importe quoi comme fraction de protéine (seuls
quelques domaines, tels que les transmembranaires, peuvent inactiver
de la sorte ce genre de fusions).

A côté de ça, pour obtenir des colonies blanches sans insert, il
suffit que le vecteur linéarisé pénètre dans la bactérie lors de la
transformation (évènement rare mais pas inexistant) pour que les
mécanismes de réparation de l'ADN se mettent en marche et rafistolent
un plasmide à nouveau circulaire, mais sans insert. Souvent, lors de
cette réparation les extrémités du plasmide linéaire sont modifiées et
des nucléotides sont supprimés afin de permettre le rafistolage des
deux extrémités. Ceci peut provoquer un shift du cadre de lecture de
lacZ-alpha, d'où les colonies blanches mais sans insert...

Pour ces raisons, des astuces ont été inventées afin de réduire la
fréquence des faux indicateurs, par exemple:

   http://tinyurl.com/6ggcd
   http://tinyurl.com/45tqv

Evidemment, il n'y a jamais de système qui soit absolument parfait. Il
faut juste s'imaginer que, sur la boîte de Petri comme dans la vraie
vie, rien n'est toujours strictement bleu ou blanc.

  JM

-----

PS, pour des infos un peu plus poussées:

a) prenons pBluescript KS par exemple (http://tinyurl.com/4dyjq). Le
le "peptide" lacZ-alpha responsable de la coloration bleue des
colonies lors de l'alpha complémentation est le suivant:

   1 MTMITPSSKLTLTKGNKswvpgppsrstvsislisnscspgdplvlerpp 50
  51 prwssNSPYSESYYNSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSE 100
 101 EARTDRPSQQLRSLNGEWDAPCSGALSAAGVVVTRSVTATLASALAPAPF 150
 151 AFFPSFLATFAGFPRQALNRGLPLGFRFSALRHLDPKKLD

b) le MCS, du site KpnI au site SacI, couvre la région indiquée en
minuscules, soit les résidus 18 à 55, sur un total de 190. L'insertion
d'un fragment d'ADN dans le MCS va donc, dans le meilleur des cas,
tronquer le quart N-terminal de ce lacZ-alpha.

c) en BLASTant la séquence (a) contre la séquence naturelle de la
B-galactosidase (http://tinyurl.com/4k5mc) on constate que la région
correspondante ne commence qu'à partir du résidu 67 de lacZ-alpha
(soit, après le promoteur T7, mais ne compliquons pas les choses):

Query: 67  LAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDRPSQQLRSLNGEW 118
           LAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDRPSQQLRSLNGEW
Sbjct: 8   LAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDRPSQQLRSLNGEW 59

d) Conclusion: une insertion dans le MCS escamotera dans le meilleur
des cas une région artificielle qui n'appartient pas à la
B-galactosidase et interrompra la transcription et la traduction. Dans
les autres cas, si l'insertion restaure intrinsèquement la
transcription et la traduction du reste du peptide, ou si le fragment
inséré respecte et n'interrompt pas le cadre de lecture, une activité
B-galactosidase aussi bonne (ou parfois, même meilleure!) que celle
obtenue avec le vecteur vide sera observée.

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