On Thu, 20 Jan 2005 11:33:54 +0900, Charles Plessy
<p-l-e-s-s-y-RemoveDashes@riken.jp> wrote:

Jerry M. wrote:

On Wed, 19 Jan 2005 22:15:17 +0900, Charles Plessy
<p-l-e-s-s-y-RemoveDashes@riken.jp> wrote:

Bonjour à tous,

je souhaite radiomarquer un ribo-oligonucléotide, avec pour
condition expresse qu'il ne soit phopsphorylé ni en 5' ni en 3'.

Je m'apprête donc à commander du 5'32P pCp, et le lier à
l'arrière de mon oligo avec l'ARN ligase du phage T4.

 
Pourquoi pCp? 

parce que je n'ai pas trouvé pAp, ou pApA, pardi !

J'ai une enzyme qui te produit -entre autres- du pGp et du pGpG à
partir de GTP et je te la vends pas trop cher mon ami, ça t'intéresse?
;-)

Ca existe?

Oui

Combien ça coûte?

400 dollars environ (Amersham).

Ca va, mais je n'ai toujours pas compris pourquoi, pour ce même prix,
tu ne marquerais pas ton oligo avec de l'ATP chaud et de la
polynucléotide kinase, comme tout le monde (cf plus bas)...

Ton oligo devrait donc être prêt à l'emploi, tu peux le marquer sans
problème avec du 5'32P-ATP et de la T4 polynucleotide kinase, comme
tout le monde, non?

Non, je veux le liguer en 5' d'un autre ARN. Donc, s'il est 5'P, il
peut s'homodimériser ou se circulariser, et comme il a vocation à
être en excès dans la solution...

Je ne comprends pas, tu veux:

  a) marquer ton oligoribonucléotide?
  b) liguer ton oligoribonucléotide à quelque chose d'autre?
  c) a et b sont vrais?
  d) toutes les antérieures sont fausses?

Si la réponse est seulement 'a', tu prends ton oligo, de l'ATP*, de la
PNK et tu fais:

   5'OH-NNNNNNNNN-OH3' ---> 5'P*-NNNNNNNNN-OH3'

Si la réponse est 'b' ou 'c', tu prends ce produit, ton second truc
quelque chose d'autre que tu veux liguer avec, de la RNA ligase, de
l'ATP, et tu fais:

  ...nnnnn-OH3' + 5'P*-NNNNNNNNN-OH3' ---> ...nnnnnP*NNNNNNNNN-OH3'

Non?

Evidemment, tu auras aussi inévitablement d'autres ligations non
voulues, comme toujours, mais si c'est vraiment important le produit
désiré pourra toujours être purifié par la suite, par HPLC, par PAGE
ou par n'importe quoi d'autre...

Re-non?

Ma question est donc, connaissez-vous un autre substrat que
le pCp, genre pNpN, qui serait vendu par un quelconque fournisseur ?

Il me semble qu'on pouvait trouver ce genre de bizarreries chez
http://www.tebu-bio.com, mais je me demande si c'est bien ce dont tu
as besoin...

Je ne vois rien sur leur site. Peut-être avaient-ils un rôle d'importateur?

Oui sans doute, il y a de sacrés traffics qui se font entre compagnies
avec les produits rares et exotiques. Pour des besoins particuliers il
faut les contacter, ils ont été très arrangeants pour moi, allant
jusqu'à me faire parvenir un produit qui n'était soit-disant
disponible qu'aux USA et pas chez eux...

  JM